Định tính, định lượng tanin trong Ngũ bội tử (Galla chinensis)

3.1.6. Định tính, định lượng tanin

3.1.6.1. Định tính tanin trong Ngũ bội tử (Galla chinensis)

* Chiết tanin từ dược liệu

Lấy khoảng 1,00g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc được dùng để định tính.

* Các phản ứng định tính

a. Ống 1: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl₃ 5% (TT) sẽ xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt.

b. Ống 2: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT) sẽ xuất hiện tủa bông.

c. Ống 3: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% sẽ xuất hiện tủa bông trắng.

d. Phản ứng Stiasny (Phân biệt tanin pyrogallic và pyrocatechic)

Lấy 10ml dịch lọc, thêm vào đó 2ml formol và 1ml HCl đậm đặc. Nếu không có tủa là tanin pyrogallic, nếu có tủa là tanin pyrocatechic.

Nếu dược liệu có cả hai loại tanin thì sau khi làm phản ứng Stiasny tạo ra tủa thì lọc qua giấy lọc để loại tủa tanin pyrocatechic, thêm vào dịch lọc natri acetat dư rồi thêm dung dịch FeCl₃ 5% (TT) sẽ xuất hiện tủa xanh đen.

e. Phản ứng xác định tanin catechic

Lấy 0,20g bột dược liệu cho vào 1 bình nón nhỏ, cho vào đó 10ml methanol đun cách thủy đến sôi. Sau khi nguội lọc qua giấy lọc. Lấy 1ml dịch lọc, cho vào đó 0,5ml dung dịch vanilin 1% và 1ml HCl đậm đặc. Nếu có tanin catechic sẽ xuất hiện màu đỏ đậm.

g. Định tính tanin bằng sắc ký lớp mỏng

Bản mỏng silicagen tráng sẵn GF₂₅₄ (Merck), hoạt hóa ở 110⁰C trong 1 giờ.

Dung dịch thử: lấy 0,5g bột Ngũ bội tử thêm 3ml methanol ngâm trong 15 phút, thỉnh thoảng lắc, lọc lấy dịch lọc làm dung dịch thử.

Hệ dung môi khai triển: cloroform - ethyl acetat - acid formic (5 : 5 : 1)

Có thể tiến hành với dung dịch đối chiếu acid gallic trong methanol (1ml chứa 1mg acid gallic).

Thuốc thử phun hiện màu: pha 10ml dung dịch FeCl₃5% trong ethanol. Tanin sẽ kết hợp với ion Fe³⁺ tạo ra phức chất có màu xanh, xanh lục hoặc xanh đen.

3.1.6.2. Định lượng tanin bằng phương pháp bột da (DĐVN IV)

Cân chính xác một khối lượng bột dược liệu đã rây qua rây số 355 (kích thước mắt rây 0,355mm) và chứa khoảng 1g tanin, cho vào 1 bình nón, thêm 150ml nước và đun trên cách thủy trong 30 phút. Để nguội, chuyển hỗn hợp vào bình định mức 250ml, thêm nước vừa đủ tới vạch, lọc. Dịch lọc này dùng làm dung dịch thử.

- Định lượng toàn phần chất chiết được trong nước: lấy chính xác 25ml dung dịch thử đem bốc hơi đến khô, sấy cắn ở 105⁰C trong 3 giờ. Cân, được khối lượng T₁(g).

- Định lượng chất chiết được trong nước không liên kết với bột da: lấy chính xác 100ml dung dịch thử, thêm 6g bột da khô (TT). Lắc đều trong 15 phút và lọc. Lấy chính xác 25ml dịch lọc đem bốc hơi đến khô, sấy cắn ở 105⁰C trong 3 giờ. Cân, được khối lượng T₂ (g).

- Định lượng chất chiết được trong dược liệu liên kết với bột da: lấy chính xác 100ml nước cất, thêm 6g bột da khô (TT). Lắc đều trong 15 phút và lọc. Lấy chính xác 25ml dịch lọc bốc hơi đến khô, sấy cắn ở 105⁰C trong 3 giờ. Cân, được khối lượng T₀ (g).

Hàm lượng phần trăm (%) tanin trong dược liệu tính theo công thức:

a: khối lượng dược liệu khô kiệt (g)

3.1.6.3. Định lượng tanin bằng phương pháp oxy hóa (DĐVN I)

Cân chính xác 2g dược liệu đã tán nhỏ qua rây số 355 cho vào 1 bình nón. Đổ thêm 50ml nước sôi và đun cách thủy, vừa đun vừa khuấy trong 30 phút. Để yên vài phút rồi lọc qua bông vào một bình định mức 250ml. Chú ý đừng để bột dược liệu rơi trên bông. Tiếp tục chiết như trên vài lần cho tới khi dịch chiết không cho phản ứng với tanin (thử với dung dịch FeCl₃). Để nguội rồi cho thêm nước vào bình định mức tới vạch.

Lấy 25ml dung dịch trên vào một bình nón 1000ml, thêm 750ml nước và 25ml dung dịch sulfo - indigo (CT). Định lượng bằng dung dịch kali pemanganat 0,1N cho tới khi chuyển sang màu vàng.

1ml dung dịch KMnO₄ 0,1N tương ứng với 0,004157g tanin tinh khiết. Song song tiến hành định lượng 1 mẫu kiểm tra trắng gồm 25ml dung dịch sulfo - indigo (CT) và 750ml nước.

Hàm lượng phần trăm tanin trong dược liệu được tính theo công thức:

a: số ml dung dịch KMnO₄ 0,1N dùng cho mẫu thử

b: số ml dung dịch KMnO₄ 0,1N dùng cho mẫu trắng

Định tính coumarin trong rễ Bạch chỉ (Radix Angelicae dahuricae)

3.1.5. Định tính coumarin trong rễ Bạch chỉ (Radix Angelicae dahuricae)

3.1.5.1. Chiết xuất coumarin

Cân khoảng 1g bột Bạch chỉ, cho vào một ống nghiệm lớn hoặc một bình nón dung tích 50ml. Thêm 5ml ethanol 90%, quấy đều. Đun trong nồi cách thủy sôi khoảng 3 - 5 phút. Lọc nóng qua giấy lọc. Dịch chiết thu được để làm các phản ứng định tính và sắc ký lớp mỏng.

3.1.5.2. Tiến hành phản ứng

a. Phản ứng mở đóng vòng lacton

- Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết

Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%

Ống 2 để nguyên

- Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi. Để nguội rồi quan sát

                   Ống 1: có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng

                   Ống 2: trong

- Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát

                   Ống 1: trong suốt

                   Ống 2: có tủa đục

Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại tủa đục như ống 2.

Dựa vào độ tan trong cồn và trong nước của coumarin để giải thích quá trình mở và đóng vòng lacton.

b. Phản ứng diazo hóa

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vào đó 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo sẽ có màu đỏ gạch.

c. Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)

Nhỏ vài giọt dịch chiết coumarin lên giấy thấm. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu,…) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại sẽ thấy: phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che. Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sẽ sáng dần lên, sau vài phút cả hai phần đều phát quang như nhau.

d. Sắc ký lớp mỏng

Bản mỏng sắc ký: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF₂₅₄ (Merck), hoạt hóa ở 110⁰C trong 1 giờ.

Dung môi khai triển: tùy trường hợp có thể sử dụng các hệ dung môi sau:

- Hệ 1: Toluen - ethyl format - acid formic (50 : 40 : 1)

- Hệ 2: Benzen - aceton (9 : 1)

- Hệ 3: Benzen - ethyl acetat (95 : 5)

Sau khi khai triển, quan sát các vết bằng đèn tử ngoại, sau đó hiện màu bằng dung dịch I₂/KI (0,2g I₂ và 0,4g KI/100ml H₂O).

Định tính flavonoid trong dược liệu

3.1.4. Định tính flavonoid trong dược liệu

3.1.4.1. Định tính flavonoid trong Hòe (Flos Styphnolobii japonici imaturi)

* Chiết xuất:

Cân 0,5g bột nụ hoa hòe rồi cho vào ống nghiệm lớn. Thêm 5ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc được tiến hành các phản ứng định tính và sắc ký lớp mỏng.

* Tiến hành phản ứng:

a. Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt). Để yên một vài phút, dung dịch sẽ chuyển từ màu vàng sang màu đỏ.

b. Phản ứng với kiềm

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% sẽ thấy xuất hiện tủa vàng. Thêm 1ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch sẽ được tăng thêm.

Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên. Nhỏ một giọt khác làm chứng.

c. Phản ứng với FeCl₃

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch FeCl₃ 5%. Sẽ xuất hiện tủa xanh đen.

d. Phản ứng diazo hóa

Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, KOH, Na₂CO₃), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều (có thể đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút) xuất hiện màu đỏ.

Các phản ứng định tính có thể thực hiện trên khay sứ.

e. Sắc ký lớp mỏng

Bản mỏng sắc ký: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF₂₅₄ (Merck), hoạt hóa ở 110⁰C trong 1 giờ.

Cô đặc dịch chiết còn lại rồi dùng mao quản chấm lên bản mỏng silicagel (kích thước 2,5 x 10cm). Chấm một vết rutin chuẩn để so sánh.

Dung môi khai triển: ethyl acetat - acid formic - nước (80 : 10 : 10)

Sau khi khai triển sắc ký, quan sát các vết dưới đèn tử ngoại, vết rutin sẽ có huỳnh quang nâu, sau đó hiện màu bằng hơi amoniac, dung dịch KOH 5% trong ethanol hoặc dung dịch AlCl₃ trong ethanol, vết rutin sẽ có màu vàng

3.1.4.2. Định tính các hợp chất anthoxyan trong hạt Đỗ đen (Semen Vignae cylindricae)

Cho vào ống nghiệm lớn 10 hạt đỗ đen và 5ml nước. Đun sôi trong 5 phút. Gạn lấy dịch chiết.

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vài giọt HCl 10%, sẽ có màu đỏ.

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vài giọt NaOH 10%, sẽ có màu xanh.

Định tính, định lượng anthranoid trong dược liệu

3.1.3. Định tính, định lượng anthranoid trong dược liệu

3.1.3.1. Định tính hợp chất anthranoid trong dược liệu

a.  Phản ứng Borntraeger

Nguyên tắc của phản ứng: Các hợp chất anthranoid khi tác dụng với kiềm (amoniac, natri hydroxyd hoặc kali hydroxyd) sẽ tạo các dẫn chất phenolat có màu đỏ sim tan trong nước.

*    Định tính dạng tự do

·       Chiết xuất

Lấy một lượng dược liệu thích hợp cho vào ống nghiệm lớn (10ml). Thêm 5ml nước cất. Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 50ml. Làm nguội dịch lọc. Thêm 5ml ether (hoặc cloroform). Lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước. Giữ lớp ether (hoặc cloroform) để làm phản ứng.

·       Tiến hành phản ứng:

- Lấy 1ml dịch chiết ether (hoặc cloroform) cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch amoniac 10%. Lắc nhẹ. Lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp ether (hoặc cloroform) có màu vàng chứng tỏ trong dược liệu có chứa acid chrysophanic. Thêm tiếp tục từng giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp dung môi hữu cơ sẽ mất màu vàng, còn lớp nước sẽ đỏ thẫm hơn lúc ban đầu.

- Lấy 1ml dịch chiết ether (hoặc cloroform) cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp nước sẽ có màu đỏ sim.

- Lượng dược liệu thích hợp cho phản ứng:

Đại hoàng: 0,5g

Cốt khí củ, Thảo quyết minh, Hà thủ ô đỏ: 1g

*  Định tính anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự do)

Cho vào ống nghiệm lớn một lượng dược liệu thích hợp. Thêm 5ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Tiếp tục lọc và chiết như ở trên.

- Lấy 1ml dịch chiết ether (hoặc cloroform), thêm 1ml dung dịch amoniac. Lắc nhẹ. Lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp ether có màu vàng thì tiếp tục nhỏ từng giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp ether sẽ mất màu còn lớp nước thì màu sẽ đỏ đậm hơn.

- Lấy 1ml dịch chiết ether (hoặc cloroform) cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp nước sẽ có màu đỏ sim.

Ghi chú:

Với dược liệu Hà thủ ô đỏ, muốn phản ứng lên rõ hơn có thể tiến hành như sau:

Lấy khoảng 0,5g bột dược liệu. Thêm 5ml dung dịch NaOH 2% trong ethanol. Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi. Pha loãng với đồng lượng nước cất. Lọc nóng dung dịch vào trong bình gạn dung tích 50ml. Acid hóa đến phản ứng acid nhẹ. Thêm 5ml ether. Lắc mạnh. Tiến hành phản ứng định tính với dịch chiết ether như đã nêu ở trên.

b. Sắc ký lớp mỏng

- Dung dịch thử: Lấy 0,1g bột dược liệu (Đại hoàng) cho vào bình nón, thêm 30ml nước cất và 1ml acid hydrocloric đậm đặc (TT) đun cách thủy 15 phút. Để nguội, lọc, lắc dịch lọc với 25ml ether (hoặc cloroform). Gạn lấy lớp ether (hoặc cloroform), lọc qua natri sulfat khan. Bốc hơi dịch ether (hoặc cloroform) đến cắn. Hòa tan cắn bằng 1ml cloroform.

- Dung dịch đối chiếu: Hòa tan acid chrysophanic trong cloroform, nếu không có chất chuẩn đối chiếu acid chrysophanic, dùng bột Đại hoàng (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như dung dịch thử.

- Bản mỏng Silicagel GF₂₅₄ đã hoạt hóa ở 105⁰C trong 1 giờ.

- Dung môi khai triển: Ether dầu hỏa - ethyl acetat - acid formic (75 : 25 : 1).

- Cách tiến hành: Chấm riêng rẽ lên bản mỏng mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366nm. Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết phát huỳnh quang màu vàng, có cùng giá trị R_f với acid chrysophanic trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Các vết huỳnh quang vàng chuyển thành màu đỏ khi hơ bản mỏng trong hơi amoniac hoặc phun thuốc thử KOH 5%/EtOH. Nếu dùng dược liệu đối chiếu, trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng màu sắc và giá trị R_f với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

c. Các phản ứng vi hóa

·             Phản ứng vi hóa

Cắt một lát vi phẫu mỏng, không tẩy rửa, không nhuộm. Đặt lát cát vào trong hộp petri có chứa hơi amoniac. Sau một thời gian soi lát cắt dưới kính hiển vi. Các tổ chức có chứa các dẫn chất anthranoid sẽ có màu nâu đỏ.

·            Vi thăng hoa

Trải bột dược liệu thành lớp mỏng trong một nắp chai bằng nhôm, đốt nhẹ trên đèn cồn để loại nước. Sau đó đậy lên nắp nhôm một miếng lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5 - 10 phút. Lấy lam kính ra để nguội, soi kính hiển vi thấy tinh thể hình kim màu vàng. Sau khi nhỏ dung dịch natri hydroxyd lên lam kính, dung dịch sẽ có màu đỏ.

3.1.3.2. Định lượng hợp chất anthranoid

a. Định lượng anthranoid trong Đại hoàng theo Dược điển Việt Nam IV

Tiến hành:

Cân chính xác khoảng 0,1g bột dược liệu đã rây qua rây có kích thước mắt rây 0,180mm, cho vào bình nón có dung tích 250ml. Thêm 30ml nước cất và đun hồi lưu trong cách thủy 15 phút. Để nguội, thêm 50mg natri hydrocarbonat, lắc đều trong 2 phút. Ly tâm, lấy 10ml dịch trong cho vào một bình cầu dung tích 100ml, thêm vào đó 20ml dung dịch sắt (III) clorid 2% và đun hồi lưu trong cách thủy 20 phút. Sau đó thêm 1ml dung dịch acid hydrocloric đậm đặc và tiếp tục đun hồi lưu 20 phút nữa. Để nguội, chuyển tất cả hỗn hợp vào một bình gạn và chiết với ether ethylic ba lần, mỗi lần 15ml. Lọc lớp ether qua bông vào một bình định mức 100ml. Rửa phễu với ether và thêm ether tới vạch. Lấy chính xác 10ml dịch chiết ether cho vào cốc có mỏ dung tích 50ml và bốc hơi đến cắn.

Hòa tan cắn với 10ml dung dịch magnesi acetat 0,5% trong methanol, đo độ hấp thụ ở bước sóng 515nm với mẫu trắng là methanol.

Hàm lượng phần trăm dẫn chất hydroxyanthracen tính theo rhein, được tính theo công thức:

 

Theo quy định của Dược điển Việt Nam IV, dược liệu Đại hoàng phải chứa ít nhất 2,2% dẫn chất hydroxyanthracen tính theo rhein.

 b.Định lượng anthranoid trong dược liệu bằng phương pháp đo quang

Nguyên tắc:

Dùng acid acetic để thủy phân các dạng anthraglycosid thành dạng aglycon. Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ (ether hoặc cloroform). Tiến hành phản ứng Borntraeger với dịch chiết. Đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 515nm.

Các bước tiến hành:

·       Chiết xuất

Cân chính xác a gam bột dược liệu (0,050g nếu là Đại hoàng, 0,100g nếu là các dược liệu khác: Cốt khí củ, Thảo quyết minh, Hà thủ ô đỏ …). Cho dược liệu vào bình cầu hoặc bình nón dung tích 250ml có lắp ống sinh hàn hồi lưu. Thêm 7,5ml acid acetic băng. Đun sôi trong 15 phút trên bếp điện có lưới amiang. Sau khi để nguội thêm vào bình (qua ống sinh hàn ngược) 30ml cloroform. Đun sôi 15 phút trên nồi cách thủy. Làm nguội dịch chiết. Gạn hỗn hợp cloroform - acid qua phễu có giấy lọc vào bình gạn dung tích 100ml (giấy lọc gấp nếp nhỏ đến mức độ tối thiểu có thể). Bột trong bình cùng với giấy vừa lọc lại được đun hồi lưu tiếp tục với 20ml cloroform trong 10 phút. Gạn dịch chiết qua phễu có giấy lọc vào bình gạn trên. Rửa bình và giấy lọc với 10ml cloroform. Gộp các dịch chiết cloroform.

·           Làm phản ứng màu

Cho từ từ vào bình gạn có chứa dịch chiết cloroform 15ml dung dịch NaOH 40%. Lắc nhẹ, (phản ứng tỏa nhiệt, nếu cần, làm lạnh bình gạn dưới vòi nước lạnh). Thêm vào bình gạn 25ml dung dịch NaOH 5% có chứa 2% amoniac. Lắc đều. Gạn lớp nước có màu đỏ vào bình định mức 100ml. Tiếp tục lắc lớp cloroform với dung dịch NaOH 5% có chứa 2% amoniac đến khi lớp nước không còn có màu. Thêm dung dịch NaOH 5% có chứa 2% amoniac vào bình định mức đến đủ 100ml. Rót dung dịch ra một cốc có mỏ dung tích 200ml rồi đặt lên nồi cách thủy sôi trong 20 phút. Để nguội rồi cho lại vào bình định mức. Thêm dung dịch NaOH 5% có chứa 2% amoniac cho đủ 100ml.

·           Đo mật độ quang

Đo mật độ quang ở bước sóng 515nm, cốc đo dày 1cm với mẫu trắng là dung dịch NaOH 5% có 2% NH₄OH.

·           Thành lập đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính

- Pha dung dịch mẫu chuẩn

Nguyên tắc: Cân chính xác 0,0100g acid chrysophanic hòa tan hoàn toàn trong 10ml cloroform. Dung dịch này được làm phản ứng màu Borntraeger theo phương pháp của Auterhoff.

Cho từ từ 15ml NaOH 40%, rồi 25ml dung dịch NaOH 5% có 2% NH₄OH vào dung dịch trên, lắc, gạn lớp nước màu đỏ vào một bình định mức có dung tích 100ml, rồi lại lắc tiếp với dung dịch NaOH 5% có 2% NH₄OH đến khi không màu. Gạn dung dịch màu vào bình định mức trên, thêm dung dịch NaOH 5% có 2% NH₄OH cho đủ 100ml. Dung dịch này là dung dịch mẹ (nồng độ 0,1% = 10.10^-3%) dùng pha các mẫu có nồng độ khác nhau để đo mật độ quang học.

- Pha dung dịch đo quang

Từ dung dịch mẫu chuẩn 10.10^-3% pha một thang nồng độ từ 0,5.10^-3 đến 2,5.10^-3%.

Lấy 5ml  dung dịch 10.10^-3% pha thành 100ml, được dung dịch có nồng độ 0,5.10^-3%. Tương tự lấy 10ml, 15ml, 20ml và 25ml dung dịch 10.10^-3% pha thành 100ml, được dung dịch có nồng độ tương ứng là 1,0.10^-3%; 1,5.10^-3%; 2,0.10^-3% và 2,5.10^-3%.

- Đo mật độ quang học của thang dung dịch acid chrysophanic chuẩn ở bước sóng 515nm.

Nồng độ	0,5.10-3	1,0.10-3	1,5.10-3	2,0.10-3	2,5.10-3
Độ hấp thụ A	0,125	0,232	0,353	0,465	0,578

Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang học với nồng độ.

Đường chuẩn định lượng anthranoid trong dược liệu theo acid chrysophanic

Từ mối tương quan giữa mật độ quang học với nồng độ là tuyến tính, xây dựng được phương trình hồi quy tuyến tính y = 227,8x + 0,0098 với r² = 0,999872 hay r² = 1 trong đó y là mật độ quang học (A) và x là nồng độ.

·           Tính kết quả

Hàm lượng phần trăm dẫn chất hydroxyanthracen trong dược liệu tính theo acid chrysophanic,  được tính theo công thức:   

 

 A: mật độ quang học của dung dịch màu

m: khối lượng dược liệu

h: hàm ẩm dược liệu

x: hàm lượng phần trăm dẫn chất anthraquinon trong dược liệu

Ghi chú:

Kết quả thu được từ phương pháp trên là hàm lượng anthranoid toàn phần, bao gồm dạng tự do, dạng glycosid, dạng oxy hóa và dạng khử. Nếu muốn định lượng riêng từng dạng thì cần chú ý:

- Nếu muốn định lượng dạng tự do, bỏ qua quá trình thủy phân với acid acetic.

- Nếu muốn định lượng dạng oxy hóa thì bỏ qua quá trình đun nóng 20 phút trước khi đo mật độ quang học.

- Hàm lượng anthranoid dạng khử được tính từ mật độ quang của hiệu số 2 lần đo trước và sau khi đun nóng.

- Nồng độ dạng glycosid là hiệu số giữa nồng độ phần trăm dạng anthranoid toàn phần và dạng tự do.

Kiểm nghiệm dược liệu chứa saponin

3.1.2. Kiểm nghiệm dược liệu chứa saponin

3.1.2.1. Định tính saponin trong dược liệu

- Quan sát hiện tượng tạo bọt

Cho vào ống nghiệm lớn 0,1g bột dược liệu, thêm 5ml nước. Lắc mạnh trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt. Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin.

- Sắc ký lớp mỏng

Dược liệu sử dụng: Cát cánh, Viễn chí, Mạch môn, Ngưu tất.

Lấy 2g bột dược liệu, thêm 10ml methanol, đun hồi lưu cách thủy 20 phút, lọc lấy dịch chiết, thủy phân dịch chiết bằng acid HCl 5% khoảng 1 giờ. Sau khi thủy phân chiết bằng 5ml CHCl₃. Dịch chiết trên dùng chấm sắc ký.

Bản mỏng sắc ký: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF₂₅₄ (Merck), hoạt hóa ở 110⁰C trong 1 giờ, bảo quản trong bình hút ẩm để chấm sắc ký.

Hệ dung môi khai triển CHCl₃ - MeOH (19 : 1).

Sau khi khai triển sắc ký, quan sát các vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và 365nm, sau đó phun thuốc thử vanillin/acid sulfuric đặc.

Sau khi phun, sấy bản mỏng ở 105⁰C trong 5 phút, quan sát và ghi kết quả.

3.1.2.2. Xác định chỉ số phá huyết của bồ kết

* Định nghĩa chỉ số phá huyết (CSPH)

Chỉ số phá huyết là số ml dung dịch đệm cần thiết để hoà tan saponin có trong 1 gam nguyên liệu (dược liệu, bột saponin) để gây ra hiện tượng phá huyết đầu tiên và hoàn toàn đối với một loại máu đã chọn, tiến hành trong điều kiện quy định.

* Phương pháp tiến hành:

Chuẩn bị các dung dịch cần thiết:

a) Dung dịch đệm: Dung dịch đệm phosphat

b) Dung dịch máu thỏ 2% đã loại fibrin

Cho vào bình định mức dung tích 50,0ml, 20ml dung dịch đệm, thêm chính xác 1,0ml dung dịch máu thỏ đã loại fibrin. Lắc nhẹ. Thêm dung dịch đệm vừa đủ 50,0ml.

    c) Dung dịch bồ kết 0,02%

- Pha dung dịch bồ kết 1%

Cân chính xác 0,5g bột bồ kết đã tán nhỏ. Cho bột vào bình nón dung tích 100ml. Cho thêm 50ml dung dịch đệm vừa đun sôi. Lắc và đặt trên nồi cách thuỷ sôi. Đun sôi trong 30 phút. Lọc nóng qua bông vào trong cốc có mỏ. Để nguội. Chuyển dung dịch vào trong bình định mức 50,0ml. Tráng bình nón bằng dung dịch đệm và lọc qua lớp bông đã sử dụng. Thêm dung dịch đệm đến đủ 50,0ml. Lắc đều.
     - Pha dung dịch bồ kết 0,02%

Hút chính xác 1,0ml dung dịch bồ kết 1% cho vào bình định mức dung tích 50,0ml. Thêm dung dịch đệm vừa đủ đến vạch. Lắc đều.

Lấy 20 ống nghiệm nhỏ (5ml), đánh số thứ tự từ 1 đến 20 và cho vào mỗi ống lần lượt các dung dịch theo bảng sau:

STT	DD đệm (ml)	DD bồ kết 0,04% (ml)	DD máu 2% đã loại fibrin (ml)
1	0,95	0,05	1
2	0,90	0,10	1
3	0,85	0,15	1
4	0,80	0,20	1
5	0,75	0,25	1
6	0,70	0,30	1
7	0,65	0,35	1
8	0,60	0,40	1
9	0,55	0,45	1
10	0,50	0,50	1
11	0,45	0,55	1
12	0,40	0,60	1
13	0,35	0,65	1
14	0,30	0,70	1
15	0,25	0,75	1
16	0,20	0,80	1
17	0,15	0,85	1
18	0,10	0,90	1
19	0,05	0,95	1
20	0,00	1,00	1

Trộn đều dung dịch bằng cách bịt đầu ống nghiệm bằng ngón tay cái và dốc ngược dung dịch một cách nhẹ nhàng (làm tất cả với 20 ống nghiệm). Để yên 2 giờ.

Quan sát hiện tượng phá huyết:

Các ống nghiệm từ 1 - 20 sẽ có màu từ hồng nhạt đến hồng. Những ống có màu hồng, trong suốt, đáy ống không có tủa là có sự phá huyết hoàn toàn. Những ống còn hồng cầu ở đáy, lắc lên thấy đục là chưa được phá huyết hoàn toàn. Xác định ống gây ra sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn (là ống có màu hồng trong suốt nhưng ống trước đó vẫn còn hồng cầu lắng tủa).

Tính chỉ số phá huyết:

Chỉ số phá huyết được tính theo công thức sau:

C: nồng độ của dung dịch bồ kết

X: là số ml dung dịch bồ kết đã cho vào ống nghiệm mà ở ống đó có sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn.